Metode de diagnostic pentru bolile virale și virale ale plantelor

Metoda de diagnostic vizual

În cele mai multe cazuri, nu este dificil să se determine natura virală a bolii. De obicei, este determinată de semne externe, cum ar fi patternuri clorotice liniare sau modele de inel pe frunzele tinere. Cu toate acestea, identificarea lor este adesea dificilă, deoarece virusurile au un caracter de dezvoltare asimptomatic (latent). Simptomele depind de starea organismului, de agresivitatea tulpinii patogene, de condițiile de mediu și de durata în care virusul sau viroidul rămâne în celulele gazdă. De exemplu, simptomele bolii sunt exprimate clar la plantele care cresc în lumină puternică și la temperatură moderată, la temperatură ridicată și în iluminare slabă, simptomele bolii pot să nu fie exprimate deloc.

Clarificarea venelor celor mai tinere frunze este adesea unul dintre primele semne ale unei infecții virale sistemice. Venele devin galbene și translucide. Frunzele care se formează mai târziu pot fi mozaic, pete, sau complet galbene (clorotice)..

Perioada de incubație a bolii depinde de tipul de virus, de planta gazdă și de condițiile de mediu, dar în orice caz este de câteva zile sau săptămâni.

Dacă primele simptome ale virozei sunt vizibile pe răsaduri, atunci sursa de infecție a fost fie în semințe, fie infecția a apărut printr-un purtător. Dacă plantele infectate sunt localizate în cultură complet din greșeală sau numai în rânduri plantate din același lot, atunci acest lucru indică faptul că materialul de plantare a fost cel mai probabil infectat. Dacă plantele bolnave se găsesc în anumite zone ale câmpului și aspectul zonelor infectate se datorează diferențelor de sol, există toate motivele pentru a presupune răspândirea virusurilor prin sol.

De asemenea, trebuie menționat că există simptome caracteristice virozei, dar cauzate de alte cauze (leziuni de fitoplasme, unele bacterii și dăunători care sugă). Simptomele similare unei infecții virale sunt adesea cauzate de tulburări de nutriție minerală, precum cele asociate cu deficiența de fier (Fig. 1). Diferitele deformări ale organelor pot fi cauzate de regulatoare de creștere și erbicide de natură diferită (Fig. 2).

Astfel, folosind metoda de diagnostic vizual, identificarea exactă prin semne externe de deteriorare cauzată de viruși și viroizi este imposibilă, un răspuns clar poate fi obținut doar prin metode instrumentale (test imunosorbent legat de enzimă, analiză PCR etc.).

Metoda plantelor indicatoare

Metoda plantelor indicatoare - Este o metodă foarte obișnuită pentru diagnosticarea bolilor virale și viroidiene și identificarea agenților patogeni. Metoda plantelor indicatoare se bazează pe utilizarea plantelor indicatoare, care, în cele mai multe cazuri, dau simptome clare și specifice caracteristice unui anumit tip de agent patogen. Plantele cu plante medicinale sunt infectate prin inoculare mecanică cu suc, drept urmare, infecția se poate manifesta ca necroză locală, decolorare și inhibare a creșterii.

Pentru virusul aspermiei de tomate, plantele tinere de tutun sunt utilizate ca indicator (Nicotiana glutinosa), pentru diagnosticul virusului X al cartofului - amarant sferic (Gomphrena globosa). Pentru a detecta infecția cu roșii cu viroid, tuberculii în formă de fus de tuberculi de cartof utilizează scopolia ca indicatori (Scopolia sinensis) sau soiuri sensibile de roșii. În unele cazuri, frunzele individuale izolate ale plantelor indicatoare pot fi utilizate pentru infecție. Virusurile care tolerează sucurile sunt grefate pe plante indicatoare prin diferite metode. În cazuri rare, pentru transmiterea virusului, se folosesc purtători de insecte și o plantă parazitară.

Metoda de diagnostic serologic

Metoda se bazează pe reacția de precipitare (formarea precipitatului) între anticorpi specifici și proteine ​​(antigene) ale agentului patogen. Metoda de diagnostic serologic nu este aplicabilă pentru identificarea viroizilor din cauza absenței unei componente proteice, precum și pentru o serie de viruși intoleranți la suc, cu proprietăți imunogene slabe. Următoarele modificări ale diagnosticului serologic pot fi utilizate pentru identificarea virusurilor dintr-o plantă:

1) Test imunosorbent legat de enzimă (ELISA) - cea mai sensibilă metodă care vă permite să obțineți estimări cantitative. Se bazează pe recunoașterea specifică a antigenilor de suprafață ai virusului de către anticorpi în prezența enzimelor. Această metodă este utilizată pe scară largă în practică pentru identificarea virusurilor de cultură, potrivite pentru analizele seriale.

2) Metoda prin picurare. Se realizează după cum urmează. Pe o lamelă de sticlă, se amestecă o picătură de suc de plante cu o picătură de antiserum. După câteva minute, reacția este evaluată la un microscop la mărire redusă pe un câmp întunecat sau chiar vizual, fără un microscop.

3) Metoda dublă difuzie - efectuat în gel de agar, pentru a determina virusurile sferice și alte mici virusuri. Se realizează prin această metodă, în unele godeuri, care sunt tăiate într-un strat de mediu agar, se adaugă antiserum, iar în altele - suc de plante purificat. În gel, particulele virale și anticorpii se difuză între ele pentru a se întâlni, iar la punctul de întâlnire formează linii de precipitare distincte în cazul specificității lor complementare.

4) Metoda imunodifuziei radiale. Folosind această metodă, antiserumul este adăugat direct la mediu agar, în timp ce godeurile sunt umplute cu seva plantelor. Reacția este pozitivă dacă se formează precipitate sub formă de inel în jurul godeurilor..

5) Metoda de adsorbție. Metoda se bazează pe faptul că, înainte de a reacționa cu un antigen, anticorpii leagă unele materiale inerte de particule mari, de exemplu, latexul. La reacția cu un antigen, apare o aglutinare clar vizibilă a întregului complex..

Metoda microscopiei electronice

Pe secțiuni ultratinice ale țesuturilor plantelor bolnave, folosind microscopuri electronice, puteți determina structura, forma și dimensiunea uniformă a virusurilor sau viroizilor. Un microscop electronic este adesea utilizat în combinație cu metode serologice (microscopie imunoelectronică) și pot fi detectate particule virale cu anticorpi stratificat. Metoda microscopiei electronice este utilizată extrem de rar datorită costului ridicat al echipamentelor și reactivilor, dificultății de izolare a virusurilor și viroizilor, oxidării secțiunilor plantelor și a unui număr de alți factori.

Metoda electroforezei

Această metodă se bazează pe separarea acizilor nucleici purificați anterior de un virus (viroid) sau proteinele sale într-un gel sub influența unui curent electric, urmată de colorarea zonelor. Metoda de electroforeză vă permite să determinați masa și dimensiunea structurilor virale sau virale. Metoda este utilizată pe scară largă pentru examinarea vizuală a produsului final al reacției în lanț a polimerazei. Pentru a înregistra rezultatele, fotografiați gelul în lumină transmisă sau reflectată.

Metodele biologice moleculare se bazează pe cunoașterea structurii moleculei ARN (ADN) a unui virus sau a virusului. Cel mai frecvent test este amplificarea (înmulțirea) secvențelor ARN specifice speciei în timpul reacției în lanț a polimerazei (PCR). Fragmentele individuale de ARN izolate din plantele studiate care sunt specifice pentru o singură specie sau gen de virusuri se înmulțesc cu enzime în prezența primerilor (oligonucleotide corespunzătoare). Mai mult, numărul lor în produsul final de reacție depășește numărul inițial de copii ale fragmentului de ARN selectat de milioane de ori. În continuare, ARN-ul viral (ADN) este detectat prin electroforeză gel sau imunofluorescență. Metoda este utilizată pe scară largă în studiile virologice practice..

Metoda sondei ADN se bazează, de asemenea, pe principiul complementarității acizilor nucleici. Sintetice specifice sunt sintetizate care hibridizează numai cu secvențe specifice de nucleotide ale unui virus sau ARN viroid. În funcție de alegerea sondelor, este posibilă diferențierea grupurilor, tipurilor și chiar a tulpinilor de viruși și viroizi.

Metoda de incluziune

După dezvoltarea virusurilor, în celulele plantelor se formează grupuri de particule virale (incluziuni) numite cristale Ivanovsky, care sunt vizibile folosind un microscop ușor convențional. Fiecare virus are propria sa formă de incluziuni virale, care se formează, cel mai adesea, în celulele epidermei frunzelor sau în celulele firelor de păr. De exemplu, virusul mozaicului de tutun are cristale hexagonale și în formă de ac - virusul X din cartof formează de obicei corpuri amorfe sferice. Pentru a detecta virusul mozaic verde pătat de castraveți, frunze de cartof răsucite și unele altele, sunt utilizate metode de diagnostic chimice analitice..