Metode de inoculare a plantelor

Înainte de a continua cu inocularea plantelor, acestea trebuie pregătite. Ar trebui să fie feriți de infecții, evident sănătoase. Pentru aceasta, plantele experimentale sunt cultivate cel mai bine din semințe sănătoase într-o seră sau o casă în creștere în ghivece de flori (ghivece de flori) umplute cu pământ fără infecții. Semințele înainte de semănat sunt dezinfectate cu agenți de pansament convenționali, iar solul este autoclavat la o presiune de 1-2 atm.

Când plantele în creștere sunt udate fără a uda suprafața frunzelor și tulpinilor (apa este turnată direct pe sol sau prin tuburi special introduse). Dacă este posibil, excludeți infecțiile extrase sau accidentale transmise de insecte sau prin aer.

Dacă plantele experimentale din experimentul cu efect de seră nu pot fi obținute din semințe, atunci plantele care cresc în stare sălbatică sunt luate și transplantate în ghivece, după care sunt păstrate în seră pentru cel puțin o perioadă (de preferință 1,5-2,0) pentru perioada de incubație a bolii cauzată de ciuperca studiată. Practic pentru asta, 7-10 zile sunt destul.

La inocularea plantelor cu ciuperci în câmp, este necesar să se izoleze în prealabil organele desemnate de la sol cu ​​rame de lemn vitrate, capace de hârtie, pungi de plastic, sticlă de liliac sau pahare de lămpi - acestea din urmă sunt legate de mize, iar orificiile superioare și inferioare sunt închise cu tampoane de bumbac . O astfel de izolare preliminară pentru o perioadă de 1-2 perioade de incubație este necesară pentru a verifica starea cu adevărat sănătoasă a organelor vegetale experimentale. Mai mult, în toate cazurile, ele se străduiesc să se asigure că plantele izolate sau organele lor se dezvoltă normal, nu sunt etiolate, clorotice, înfiorătoare etc..

Este posibil să se efectueze experimente pe părți tăiate ale plantelor scufundate în apă, într-o soluție nutritivă, precum și pe frunze separate plasate într-o soluție de benzimidazol.

Metodele de inoculare a plantelor sunt destul de diverse și depind de biologia ciupercii și de rolul infecției în patogeneza bolii, precum și de obiectivele studiului (verificarea patogenității tulpinilor, evaluarea rezistenței soiurilor etc.). Luați în considerare o serie de tehnici de inoculare care sunt destul de bine testate și care pot fi recomandate în lucrările practice..

Inocularea plantelor poate fi realizată atât de un agent patogen cultivat pe un mediu nutritiv artificial, cât și de o populație naturală de spori fungici. În funcție de sarcină, se folosesc diverse inocule - miceliu, spori colectați dintr-o varietate a plantei gazdă sau reprezentând o populație geografică etc..

La alegerea metodei de inoculare se ține cont de productivitatea muncii, deoarece mii de soiuri sunt adesea evaluate. Metodele și calendarul infecției artificiale la fel de apropiate de cele naturale. În toate cazurile, sunt create condiții care sunt optime pentru creșterea agentului patogen (temperatură, umiditate). Numărul plantelor inoculate trebuie să fie de cel puțin 10, cu control obligatoriu.

O serie de boli (smut praf de grâu și orz, secară ergotă, helmintosporioză de orz și ovăz, rugină galbenă de grâu etc.) se caracterizează prin pătrunderea infecției prin flori și ovare. În acest caz, inocularea se realizează prin aplicarea sporilor uscați sau a unei suspensii a sporilor fungici în flori și ovare. De exemplu, M.K. Khokhryakov (1969) indică faptul că cea mai simplă metodă de inoculare a grâului și orzului cu smut de praf este de a pulveriza clamidozorele agenților cauzali ai bolii în timpul înfloririi cerealelor din pungi de tifon sau a tăiat urechile afectate..

V. I. Krivchenko (1963) a modificat metoda vidului de inoculare a grâului cu agentul patogen, folosind un dispozitiv special format dintr-un cilindru în care sunt plasate urechile rămase pe viță de vie. Acest cilindru are două tuburi de ieșire, unul dintre ele fiind conectat la pompe, iar celălalt servește la furnizarea de aer. De dedesubt, printr-un dop și un furtun de strângere în vid speciale, se furnizează o suspensie de spori (0,2 g spor la 0,5 l apă). Esența metodei este că pe măsură ce se pompează din cilindru cu urechile de aer, apa cu spori intră acolo. După furnizarea aerului, suspensia curge înapoi în vas. Pentru a obține date fiabile, este suficient să infectăm 6-10 urechi dintr-un soi, iar la evaluarea familiilor și a liniilor de hibrizi, cel puțin trei urechi.

E. E. Geshele (1964) împarte metodele de inoculare a smutului în două grupe: infecția individuală a florilor și întreaga ureche. În primul caz, un spikelet superior și două inferioare sunt tăiate cu foarfece, iar florile din mijloc sunt eliminate din rest cu penseta. După aceea, fiecare floare este deschisă și se introduc sporii cu penseta. Această metodă are o serie de modificări. În special, puteți infecta o floare cu o pipetă specială cu o pere. În cel de-al doilea caz, un material care conține începutul infecției infecțioase este aplicat pe o ureche sănătoasă, după ce anterior a făcut incizii la nivelul dintelui.

Florile de orz sunt inoculate cu conidii ale agentului cauzal al helmintosporiazisului cu dungi folosind un dispozitiv de vid în perioada în care vârful nu a părăsit încă tubul, doar vârfurile copertinelor.

Florile din culturile de fructe sunt infectate cu ciuperci din genul Monilinia, prin aplicarea de conidii uscate cu capătul umezit al acului pe stigmatul dăunătorului. Apoi florile sunt pulverizate cu apă dintr-o sticlă de pulverizare și se pun pe ele un izolator de tifon înmuiat în apă, care este acoperit cu o peliculă de plastic pentru o zi. În regiunile sudice, în plus, inflorescențele inoculate sunt întunecate - fac același lucru atunci când sunt infectate cu urechile.

Ramurile de fructe inoculate sunt izolate la fel ca florile. Dacă se efectuează experimente pe lăstari tăiați, apoi după aplicarea infecției pe frunze, lăstarii se așează în camerele umede din capace de sticlă căptușite cu hârtie de filtru umedă din interior timp de 24 de ore la temperatura optimă.

Atunci când agenții infecțioși sunt aplicați pe frunze, tulpini și alte organe ale plantelor, de regulă, se utilizează o suspensie a sporilor patogeni (conidii). O acoperire de ceară pe suprafața frunzei face dificilă pătrunderea ciupercilor, astfel încât este îndepărtată înainte de inoculare lăsând frunza să treacă între degete umede. Materialul care conține infecția, de regulă, se aplică pe partea inferioară a foii sub forma unei picături a unei suspensii apoase dintr-un spray sau se freacă inoculul peste foaie cu un bisturiu. Uneori se folosesc spori uscați, care se aplică pe frunzele umezite cu o perie sterilă..

Pentru infecția artificială a frunzelor direct pe plante, camerele umede de volum mic pot fi utilizate sub formă de cupe de celofan (diametru de 20 mm) presate de-a lungul marginilor cu un arc elastic (metoda lui M. S. Dunin).

Plantele inoculate pentru o anumită perioadă de timp (12, 24, 48 de ore) sunt plasate într-o cameră umedă pentru a asigura o infecție mai completă. Pe teren, acest lucru se realizează prin aplicarea unei suspensii de spori în zilele înnorate sau seara, mai ales dacă se așteaptă rouă.

Materialul infecțios din rugina cerealelor este de obicei pregătit cu două ore înainte de aplicare pe plante. Pentru a face acest lucru, luați 200-300 de frunze afectate, scufundați-le în apă (0,5-1 l) și spălați uredosporesele din ele. Aproximativ 150 de litri de suspensie sunt cheltuiți pentru 150-200 m2 de însămânțare (L.F. Rusakov, 1926). În condiții de staționare, inoculul este pregătit în avans în seră sau pe culturi speciale. Pentru infecția parcelelor - distribuitori de rugină, trebuie luați 5 mg de uredospore pe 1 m2, pulverizându-le împreună cu talc în raport de 1:30 sau 1: 100. Cu inoculare continuă la 1 m2, se consumă 2 mg de uredospore viabile în cazul acoperirii ulterioare a plantelor cu o peliculă și 20 mg fără cameră umedă (K. M. Stepanov, 1966).

Infecția artificială a plantelor cu bazidiospores de rugină (de exemplu, liniare sau maro) se realizează într-o cameră umedă. Părți ale plantelor cu teletospore dezvoltate sunt luate și așezate deasupra plantei inoculate astfel încât, pe măsură ce se maturizează, bazidiosporesele să cadă pe suprafața sa.

Există rapoarte despre posibilitatea inoculării agenților patogeni de piriculariază și mucegai pudră cu frunze individuale de cereale plasate în camerele umede, precum și cercuri mici de frunze vii (12-14 mm în diametru) de tutun cu o ciupercă Peronospora tabacinși. În același timp, acestea sunt așezate în vasele Petri, al căror fund este căptușit cu trei straturi de hârtie de filtru saturate fără exces cu o soluție nutritivă din următoarea compoziție (în g la 100 ml apă): potasiu și tartrat de sodiu (KOSO - CHON - CHON - COONa) - 0,5- K2NRO4 - 0.1 - KNO3 - 2.0 - Co (N03) 2 - 0.06 - KCl - 0.03 - MnO4 - 0.001 și Mg04 - 0.5 (Isard, 1960).

Atunci când studiați, de exemplu, paraziții obligați ai speciilor de arbori, se folosesc metode speciale. Când lucrați cu ciuperci vocalumetice care provoacă deformarea fructelor și ramurilor, lăstarii cu semne de deteriorare tăiate de la copacii bolnavi sunt plasați în vase cu apă pentru a închide ascospores, care sunt acoperite cu un capac de sticlă largă. Sub marginea hotei, sunt plasate garnituri cu o înălțime de aproximativ 10 cm pentru accesul aerului. După 1-2 zile, sporulația marsupială a ciupercii apare pe organele afectate. Ascosporesele formate sunt transferate cu un bisturiu steril la plante experimentale sănătoase, la ovare sau dungi care încep să se dezvolte. În același timp, solzele sunt dezvăluite cu forță. De asemenea, sunt utilizate alte tehnici speciale, bazate pe biologia agenților patogeni, obiectivele experimentului și posibilitatea pătrunderii infecției în anumite condiții (Geshele, 1971).

Atunci când lucrați cu agentul cauzal al ascochitozei de mazăre, conform metodologiei Comisiei de Stat pentru Testarea Varietății, inoculul este obținut în eprubete pe agar oblic. Dintr-un epruvetă de cultură fungică, se prepară o suspensie agitând-o într-un litru de apă. Mai mult, în medie, 40-50 de conidii de agent patogen trebuie să fie conținute într-o picătură de lichid. 2 l de suspensie se consumă la 1 m2 de semănat.

Semințele pot fi inoculate uscate sau umede. Contaminarea semințelor se practică atunci când se studiază smucitul tare de grâu. În același timp, se consumă 1 kg de semințe la 1 kg de spori, în funcție de condițiile meteorologice așteptate în timpul însămânțării și în zilele următoare.Dacă vremea nu este favorabilă pentru scurgerea de smut, sarcina de infecție este crescută. Condițiile optime sunt considerate a fi temperatura solului la adâncimea seminței 6 -10 ° C. Dacă se testează loturi mici de semințe, acestea sunt polenizate cu o cantitate excesivă de spori și trecute printr-o sită. Pentru a crea încărcătura infecțioasă necesară, semințele de orz și ovăz trebuie îndepărtate din filme, iar E. E. Geshele (1964) recomandă îndepărtarea numai acele părți din film care acoperă embrionul. În alte cazuri, semințele sunt împrăștiate cu un strat subțire pe o suprafață densă, stropite cu o suspensie de spori, păstrate într-o cameră umedă. Semințele de orz și ovăz sunt, de asemenea, inoculate cu smut prin imersare într-o suspensie de spori. Pentru 100 g de semințe se prepară 100 cm3 de suspensie din 4-10 g spori. Semințele sunt ținute în suspensie timp de 15 minute, agitând bine amestecul de trei ori. Apoi, semințele sunt așezate în pungi de tifon, lăsate să se scurgă cu apă și incubate timp de 24 de ore la 20 ° C. După uscare, semințele sunt semănate.

Semințele de ovăz, care sunt contaminate cu bunturi, cu pelicule îndepărtate sunt germinate în cutii la 25 de umiditate a solului și la o temperatură de 20 ° С. După apariție, sunt transplantate pe câmp. Aceeași metodă E. E. Geshele (1964) recomandă utilizarea în caz de infecție artificială a orzului cu smut și patogen al helmintosporiozei cu dungi.

La inocularea (shtambov) pomilor fructiferi pe scoarță după 1-1,5 cm, se aplică două tăieturi transversale, între care coaja este tăiată la mijloc în direcție longitudinală, îndoindu-și aripile, făcând mai multe tăieturi de lemn superficiale și introducând cultura agentului patogen în studiu împreună cu o bucată de mediu agar. Apoi clapele corticale sunt închise și locul de infecție este acoperit cu folie sau pergament de plastic, fixând marginile cu sfoară sau bandă de canal. Când folosiți hârtie, sub pansament se pune o bucată umezită de vată umezită..

În cazul infecției ramurilor scheletice cu agenți patogeni care se pot dezvolta numai în țesuturile slăbite anterior, acestea din urmă sunt cauterizate în apropierea locului de inoculare.

În caz de infecție artificială a speciilor de arbori cu paraziți opționali (ciuperci din gen Cytospora și altele.) experimentele sunt cel mai bine efectuate în condiții de laborator pe lăstari tăiați. Pentru aceasta, se decupează din soiul de testare lăstari lignificați cu lungimea de 150 mm și grosimea de aproximativ 10 mm în cantitate de 20 buc. (10 bucăți pentru experiență și control). Apoi, la o distanță de 50 mm de la vârful lăstarului, se realizează o tăietură până la 5 mm adâncime - după sterilizarea de suprafață, se plasează în ea un mediu agar cu miceliu fungic. Locul de inoculare este strâns cu folie de plastic, care este fixat la margini cu fire sau bandă izolatoare. Pe partea inversă a filmării, bumbacul este plasat sub film, care, dacă este necesar, este umezit periodic cu o injecție de seringă prin film.

Tăierile sunt plasate în pahare cu apă sau cu nisip umed pre-calcinat. Fiind în apă sau nisip, butașii încep să lipsească mineralele solului, funcțiile lor vitale slăbesc și mor. Acest proces durează mult timp, ceea ce vă permite să determinați sincronizarea secvențelor de boală cu diferite grade de slăbire, prin urmare, capacitatea patogenă a ciupercii și a rezistenței plantelor.

Lăstarii infectați sunt comparați cu martorul folosind criteriul ordinal X, de obicei la momentul decesului a 2/3 din butașii din cel mai sensibil soi. În cazul în care formarea îmbunătățită a calusului va trece de-a lungul marginilor plăgii, rana este curățată și se efectuează inoculare secundară fără a întrerupe experimentul.

Puieții de copaci pot fi inoculați prin introducerea infecției în tulpină cu ajutorul unei seringi medicale. Puteți face un început infecțios la rădăcinile direct în sol, deteriorandu-le cu o tijă metalică (sporii patogeni sunt introduși în rana rezultată).

Inocularea fructelor și culturilor de rădăcini se realizează prin aplicarea unei suspensii a sporilor patogeni pe suprafața lor sterilă. În acest caz, puteți utiliza, de asemenea, spori uscați, străpungerea sau mușcarea pielii fătului sau puteți injecta o suspensie apoasă de spori (1 picătură) cu o seringă sub piele. Uneori, infecția este introdusă într-o tăietură profundă a culturii de rădăcini, apoi se introduce partea tăiată în locul inițial.

Cel mai adesea, inoculul este aplicat pe sol pentru a crea un fond infecțios fără a deteriora sistemele radiculare - ciuperca este propagată mai întâi pe medii speciale.

Pentru mulți ani de lucru cu o gamă largă de specii și soiuri de plante, sunt utilizate diferite fonduri infecțioase. Ele pot fi naturale și artificiale și pot varia, de asemenea, în gradul de manifestare a bolii (slab, puternic).

Atunci când se creează un fond infecțios în sol, de exemplu, agenți cauzali ai bumbacului, culturile de ciuperci pure sunt cultivate pentru prima dată în baloane cu semințe sterile de ovăz (100 de boabe la 100 cm3 de apă). Apoi culturile sunt propagate în sticle cu mediu de aceeași compoziție. Pentru fiecare 100 m2 de suprafață, se aplică 3-4 kg de cultură (o altă metodă este descrisă mai jos).

Introducerea culturilor fungice în sol este de asemenea folosită atunci când se lucrează cu agenții patogeni de ofilire (ofilire) de vinete și ardei - sclerotia agenților patogeni se folosește în timpul înmugurării plantelor cu deteriorarea preliminară a rădăcinilor.

Se efectuează inocularea răsadurilor de orz și grâu de către agenții cauzali ai helmintosporiozei, fusariumului, opiobolezului și altor agenți patogeni, introducând o cultură de ciuperci în rândurile de semințe împreună cu semințele. Se folosesc culturi pure de ciuperci cultivate pe semințe sau agar (0,5 amidon, 0,02 KH2P04, 0,02 Ca (N03) 2 0,02 peptonă și 2 agar agar). Se folosește și o secțiune de paie infectată. Rândurile în timpul însămânțării sunt acoperite cu paie infectată la viteza de 20 de plante zdrobite amestecate cu 1 kg de humus la 25 m de rând de semănat (E. E. Geshele, 1964).

Când se creează un fond infecțios cu agenți patogeni de mucegai de zăpadă, un amestec de tulpini (Fusarium NIVale, Typhula incarnata etc.), care sunt pre-cultivate pe agar acidifiat de cartofi și apoi propagate pe ovăz steril. Înainte de a introduce cultura ciupercilor în sol, acestea sunt amestecate cu pământul în cantități egale și distribuite uniform pe suprafața parcelei. Infecția este introdusă în sol toamna, în proporție de 200 g de cultură pe ovăz la 1 m2. Solul contaminat este acoperit de sus cu un strat de pământ de 1-1,5 cm.În primul an pe un fond infecțios, se realizează însămânțarea de recunoaștere. Dacă, în același timp, excreția plantei de la agenți patogeni este uniformă, atunci anul viitor complotul este folosit pentru experimente (V.K. Neofitova, N.A. Novik, 1969).

Inul de in roșu fundal infecțios (Melampsora Lini) creează cu ajutorul paiului de lince, afectat de agentul cauzal al bolii (amestec de soiuri). Astfel de paie (tulpini) este așezat toamna sub zăpadă. Primăvara, tulpinile afectate sunt ținute în apă timp de 2-3 ore și se verifică germinarea teletosporelor, germinându-le pe 50-100 de segmente ale tulpinilor într-o cameră umedă. Sporii încolțiți sunt numărați la 48 de ore după ce au fost plasați într-o cameră umedă.

Prima metodă este aplicabilă în studiul biologiei patogene și inocularea plantelor unice, a doua - în evaluarea pe teren a soiurilor.

Atunci când se creează un fond infecțios (provocator) pentru agentul cauzal al vilt verticilinei de bumbac pe parcelă în primul an, resturile de plante afectate de ciupercă (guza-pai) sunt mirosite și udate abundent. În anul următor, se face o însămânțare la nivel a cultivatorului de bumbac sensibil la această boală, după recoltare, reziduurile plantelor afectate sunt mirosite din nou. Semănatul de egalizare este, de asemenea, necesar pentru a verifica fiabilitatea unui fond provocator. Numai după o astfel de verificare poate fi considerat pregătit pentru soiurile de testare.

Infecția de in cu antracnoză (Colletotrichum lini) efectuat prin introducerea infecției în sol și pulverizarea răsadurilor cu o suspensie de spori. Ca material infecțios, sunt utilizate paiele de in afectate și răsadurile, precum și o cultură pură de patogen cultivată pe ovăz și agar de must. Pentru a infecta solul, o cultură pură de ciuperci, răsaduri bolnave și paie de in sunt încorporate în pământ. Plantele vegetative sunt inoculate cu suspensie de spori în faza de răsad (T.V. Krylova, Yu. T. Karpunina, 1969).

Când este infectat cu putregai alb de floarea soarelui (Sclerotinia Libertiana) se aplică o metodă în care, simultan cu semințele, se introduc în fiecare cuib 2-3 scleroții mici ale agentului cauzal al agentului patogen al bolii, cu ajutorul unei mașini de plantat mâini. Metoda specificată vă permite să obțineți semne ale bolii pe partea bazală a tulpinii (A. I. Lukashevich, 1969).

Creșterea stocului de mucegai pudră de floarea soarelui (Plasmopara helianthi) se efectuează după cum urmează. În primul rând, se prepară o suspensie zoosporă, pentru care frunzele afectate și un strat de hârtie de filtru umed sunt amplasate în camerele umede. Camerele umede sunt păstrate la o temperatură de 16-20 ° C. Conidele coapte sunt îndepărtate de pe suprafața frunzelor cu o lamă de ras sau un tampon umed și se prepară o suspensie. Inocularea plantelor se realizează prin menținerea în suspensie a semințelor lipicioase timp de 5-8 ore la o temperatură de 17-19 ° C. Apoi răsadurile de floarea soarelui sunt plantate în cutii cu dimensiuni de 50 × 40 × 15 cm, sere sau pământ deschis. În cutii și căzi fierbinți, plantele sunt așezate conform schemei: între rândurile 10-15, la rândul 2-3 cm - în pământ deschis - între rândurile 45-60 și la rând 3-5 cm.

Agentul cauzal al trifoiului de sclerotinie este cultivat din sclerotie pe felii de cartofi într-o cameră umedă. Apoi felii cu miceliu parazit dezvoltat sunt plasate sub plantele de la gâtul rădăcinii.

În moduri similare, o creștere a numărului de infecții în sol se realizează prin introducerea repetată a reziduurilor de plante infectate cu agenți patogeni de mucegai de floarea-soarelui, putregaiul și rădăcina rădăcinii de grâu și orz, chilă, varză, ascohitoză de mazăre etc..

Patogeni ai solului (ciuperci de naștere) Verticillium, Fusarium etc.) culturile de fructe și fructe de padure sunt pre-propagate în culturi pure pe un mediu nutritiv. De obicei, cerealele de cereale sunt utilizate ca substrat nutritiv, care sunt turnate cu apă în baloane (aproximativ în raport de 1: 1) și sterilizate într-o autoclavă la o presiune de 1 atm. Apoi, o infecție cu ciuperca corespunzătoare este introdusă în baloane cu bobul și incubată timp de 10-15 zile cu agitare periodică pentru a amesteca substratul. În același timp, semințele culturilor cu boabe goale (grâu, secară, leguminoase) sunt amestecate cu pleavă sau paie mărunțită fin pentru a evita formarea unei mase musculoase..

Ratele de aplicare a unei astfel de culturi de ciuperci în sol variază în funcție de tipul de patogen și soiul de plante. Ca suport, puteți lua 3 kg de cultură pe 120 m2 de plantații de boabe sau 1,5-2 kg pe suprafața de hrănire a unui copac (în funcție de schema de plantare).

Astfel, metodele de mai sus de inoculare a plantelor sunt foarte diverse, cu unele modificări care sunt aplicabile pentru a lucra cu aproape toți ciupercile fitopatogene pe o mare varietate de plante agricole..