Izolarea ciupercilor fitopatogene în culturi pure

După cum a subliniat N. A. Naumov (1937), setul de metode pentru izolarea și cultivarea ciupercilor variază pe o gamă largă în funcție de scopul studiului. Cu toate acestea, conceptul de experimente se încadrează într-un singur sistem. Înainte de a obține ciuperca studiată într-o cultură pură, este necesar să existe țesut purtător de spori sau miceliu, fără infecții cu microflora epifitică, care uneori denaturează imaginea, complică identificarea și izolarea țesuturilor afectate..

Una dintre cele mai simple metode de obținere a miceliei sau a organelor de sporulare (inclusiv un număr de paraziți obligați) este utilizarea așa-numitelor camere umede. De obicei utilizate pentru fabricarea lor. farfurii petri sau lui Koch. Partea inferioară a cănilor și suprafața interioară a capacelor sunt căptușite cu cercuri de hârtie de filtru cu diametrul adecvat, sterilizate la o temperatură de 110 ° C timp de două ore și umezite cu apă sterilă. Părți mici ale țesuturilor cercetate în cantitate de 3-10 eșantioane după sterilizarea la suprafață sunt așezate pe fundul cănilor direct pe hârtia filtrantă pe suprafața sa.

Sterilizarea la suprafață a părților țesuturilor bolnave poate fi efectuată folosind flacăra unui arzător de alcool (flăcări), a unui flux de apă sau a unor substanțe chimice speciale. Metoda de sterilizare a suprafeței unui substrat natural este potrivită pentru lemn, rădăcini, semințe sau fructe. Cu cât obiectul este mai voluminos, sterilizat, cu atât mai temeinic și mai lung este posibil să se încălzească, fără teamă pentru viabilitatea miceliului din țesuturi.

Uneori este necesar să se izoleze o ciupercă patogenă de materialul semi-descompus sau de părțile noroioase ale unei plante (periterapie de cicatrice pe frunzele căzute etc.) În acest caz, obiectul de testare este plasat pe o sită fină și spălat timp de câteva ore sub apă curentă.

Ulterior, materialul preluat pentru cercetare este curățat și dezinfectat suplimentar de la suprafață prin imersarea într-una dintre următoarele substanțe: 96- sau 50 de alcool timp de 2-3 minute - soluție de clorură mercurică (0.1) cu o expunere de la câteva secunde la trei minute- 0,5-1,0-nd soluție de permanganat de potasiu (până la 20 min) - soluție clarificată de albire (prima) - 0,1-1,0-nd soluție de apă de brom (câteva secunde) sau în soluții ale altor dezinfectanți urmată de spălarea în apă sterilă. În acest scop, se poate folosi o soluție de formalină de 1: 300, urmată de lăsarea obiectului din vas cu vaporii săi de la 30 de minute la 2 ore..

Studiile asupra ciupercilor care se dezvoltă în camerele umede trebuie efectuate direct în cupe, cu o mărire mică a microscopului în lumina transmisă sau reflectată..

După apariția sporulării sau a semnelor de dezvoltare a miceliului, acesta este subcultivat pe un mediu nutritiv de agar direct într-o eprubetă pentru agar oblic sau anterior pe un mediu de agar vărsat în vasele Petri. Parazitii obligatorii sunt cultivati ​​pe plante vii sau medii speciale.

Pentru lucrări suplimentare, este foarte importantă purificarea culturii. Acest lucru se realizează prin cablare în bară, diluare în apă sterilă sau folosind eprubete.

1. O cantitate mică de ciupercă este luată pe bucla de cultură și strecurată pe suprafața agarului în vasele Petri. Pe măsură ce accidentul vascular cerebral este prelungit, sporii sunt din ce în ce mai divizați până când, ca urmare, apar colonii individuale din mai multe sau singure spore.

2. Sporul de inocul este introdus într-o eprubetă cu apă sterilă (10 ml), apoi o anumită cantitate de suspensie (de exemplu, 1 ml) este transferată cu o pipetă sterilă într-o eprubetă cu 9 ml de apă sterilă. O pipetă sterilă proaspătă este folosită pentru a amesteca lichidul și a transfera 1 ml din eprubetă care conține 9 ml de apă sterilă. Creșterea continuă în funcție de nevoie. O astfel de diluție de zece mii are unele avantaje în ceea ce privește cablarea. În diluarea finală, la agarul topit se adaugă 1 ml suspensie de spori, răcit la aproximativ + 40 ° C..

3. Luați cinci tuburi de mediu agar corespunzător, topiți-l și răciți la + 45 ° C. Apoi, o cantitate mică de spori este introdusă într-unul dintre tuburi - tubul este defilat între palmele mâinilor și conținutul este turnat într-un vas Petri. Eprubeta goală este din nou umplută dintr-un alt tub de testare cu mediu topit, derulează între mâini și turnată într-o a doua cană. Această procedură se repetă cu celelalte trei epruvete..

Atunci când se efectuează cercetări teoretice sau se analizează o populație de orice formă geografică, este necesară obținerea unei culturi dintr-o dispută. Cultura aproape monosforică a multor ciuperci este obținută în următoarele moduri.

1. O suspensie slabă de spori este pregătită pe o lamă de sticlă sterilă în apă sterilă prin imersarea unei bucle umezite calcinate într-o cultură de sporulare. Această suspensie a sporilor este strecurată de-a lungul unei linii într-o farfurie Petri pe o placă de agar foarte subțire pregătită în apă fiartă și păstrată la + 24 ° C. Dacă se face acest lucru la 16-17 ore, atunci la 9-10 ore a doua zi, de obicei, se observă debutul germinării și disponibilitatea sporilor pentru izolare.

Când lucrați cu un binocular (microscop stereoscopic), vasul Petri este mutat de-a lungul liniei marcajului și sunt selectate varza corespunzătoare. Un ac corespunzător face un decupaj de hangar de aproximativ 2 mm în jurul sporei. Acest pătrat și zona imediat din jurul său sunt verificate sub o mărire mică a unui microscop biologic pentru a vă asigura că există o singură sporă.

Blocul de agar vrabie este apoi transferat folosind un ac steril sub binocular într-o placă sau tub de agar.

2. Mediul nutritiv este turnat într-un strat subțire în vasele Petri sterile, apoi se prelevează o eprubetă cu apă sterilă și se introduce o cantitate mică din sporii ciupercii și se agită bine în apă. După aceea, 4-5 picături din suspensia sporilor sunt luate cu o buclă metalică și transferate într-o lamelă de sticlă. Sub microscop, numărul de spori din fiecare picătură este contorizat. Dacă o scădere se încheie în medie n spor, se adaugă apă sterilă în tub pentru a-și crește volumul în n+1 dată.

Mai mult, putem presupune că într-o singură picătură va exista o medie a unei dispute. După aceasta, se scot 3-4 picături dintr-o eprubetă cu o suspensie diluată de spori și transferate în vasele Petri pe mediu de agar. Picăturile trebuie separate între ele la o distanță relativ mare. Sub microscop, verificați numărul de spori care se încadrează în fiecare dintre aceste picături. Vizionarea se face din partea de jos a cupei, care este întoarsă cu atenție pentru acest lucru. În același timp, acestea sunt selectate dintre picăturile în care este conținută o sporă și sunt marcate pe sticlă cu un creion de ceară. Coloniile obținute în vasele Petri sunt ecranate în tuburi de agar oblic.

Uneori, o picătură dintr-o suspensie care conține o spor este plasată pe un pahar steril într-o farfurie Petri și i se adaugă o bucată de mediu de agar - după ce miccelul de ciupercă este depășit cu ea, cultura este transferată într-o eprubetă sau vas Petri..

3. Hansen (H. R. Hansen, 1926) a folosit capilare subțiri de sticlă, coborât cu o suspensie de spori într-un mediu agar cald. Aceste capilare au fost apoi examinate microscopic și tăiate în bucăți, fiecare conținând o sporă. Astfel de piese au fost apoi supuse sterilizării la suprafață și plasate într-o placă de agar.

Puteți utiliza alte metode de obținere a culturilor monospore, care sunt indicate în literatura de specialitate (de exemplu, metoda „acului uscat” Hannah și altele). Deci, pentru a obține o cultură monosporă din uredospores, ruginile de cereale sunt agitate pe o lamă de sticlă uscată. Apoi, cu capătul tijei de sticlă trase, o spor este separată sub binocular sau cu o mărire mică a microscopului. Capătul bățului este pre-șters cu vată umezită cu spirt metilat sau alcool. Sporul selectat este transferat într-o picătură de apă într-o frunză de plante. Astfel de manipulări sunt efectuate de aproximativ 200 de ori, ținând cont că rata de supraviețuire este de obicei de 6-10.

La izolarea unei culturi monopodulare a ciupercii, se face propagarea prealabilă a populației de rugină, astfel încât uredopustulele singure să se formeze pe frunze. Pentru aceasta, pentru inoculare se utilizează o cantitate mică de spori..

După ce au primit pustulele inițiale ca urmare a unei culturi monoscuore sau monopusculare a ciupercii, acestea încep să înmulțească sporii în ele pe anumite soiuri, repetând procesul de reproducere a plantelor prin uretropode bine dezvoltate de 2-3 ori. Drept urmare, se acumulează o cantitate suficientă de inocul pentru lucrările ulterioare cu acesta.

Izolarea culturilor pure din diferite organe și țesuturi are propriile sale caracteristici. Cu deteriorarea superficială a fructului, stratul deteriorat extern este răzuit și miceliul este germinat într-o cameră umedă, urmată de recăderea coloniei pe mediu agar. Suprafața afectată anterior este complet spălată cu apă sterilă..

La izolarea culturilor de părțile interne ale fătului, acestea sunt spălate complet, dezinfectate într-o clorură de mercur (1: 100) timp de 5 minute, iar apoi spălate din nou în apă sterilă, bucățile de fructe tăiate din țesuturile interne cu un bisturiu steril sunt așezate pe agar nutritiv.

Atunci când izolați agenți patogeni care provoacă daune exterioare rădăcinilor, utilizați tehnica descrisă pentru fructe. În cazul leziunilor interne, rădăcinile sunt bine spălate, flăcate și apoi se realizează secțiuni transversale sau longitudinale. Bucățile mici de țesut intern bolnav sunt germinate pe un mediu de cultură de agar..

Izolarea ciupercilor din frunze, petale și alte organe delicate este asociată cu dificultăți cunoscute, deoarece, în acest caz, trebuie să abandonăm aproape complet sterilizarea de suprafață cu ajutorul substanțelor chimice care pot afecta patogenul miceliu din mezofil. Pentru a crește precizia și fiabilitatea lucrărilor de selecție, ar trebui să utilizați cele mai mici părți posibile ale țesuturilor, crescând totodată numărul lor total.

Ciupercile care infectează scoarța și lemnul (traheomicoza, putregaiul, necroza) pot fi izolate direct de țesutul afectat prin placare bucăți sau felii sterilizate superficial pe medii de cultură sau din spori și micelii obținute într-o cameră umedă. Lemnul și scoarța ar trebui să fie proaspete, deoarece ciupercile de mucegai se dezvoltă în epruvete înfundate care înfundă cultura..

Lemnul afectat este dezinfectat prin imersiune timp de câteva minute în alcool 95% sau 0,5% soluție de permanganat de potasiu, urmat de flacără. Apoi, părțile de suprafață ale eșantionului sunt tăiate cu un bisturiu steril sau microtom și plăcile de la câțiva microni la 5-10 mm grosime sunt tăiate din interior și transferate într-un mediu nutritiv.

La izolarea culturii de corpurile de fructe ale himenomicetelor, stratul de suprafață este mai întâi tăiat și bucăți mici, cu diametrul de 4-5 mm, sunt tăiate din interiorul purtătorului de fructe și cufundate jumătate în agar nutritiv. Apoi, miceliul dezvoltat este transferat în agar oblic.

Pentru a izola miceliul endogen de răsadurile tinere, părțile afectate nu sunt sterilizate, ci doar spălate, pentru a nu-l ucide - materialul este ușor digerat și așezat pe agar nutritiv sau într-o cameră umedă - miceliul emergent este separat rapid, încercând să împiedice creșterea microorganismelor saprofite.

Răsadurile mai vechi sunt dezinfectate într-o soluție de permanganat de potasiu 0,5%, spălate cu apă și așezate într-o cameră umedă, de unde miceliul dezvoltat este transferat într-un mediu nutritiv. De asemenea, este posibil să se utilizeze secțiuni de tulpină, care sunt așezate pe agar pentru a germina miceliul ciupercilor patogene.

Microflora semințelor bolnave este de obicei analizată după dezvoltarea sa în cultură pe un mediu nutritiv (M M. Samutsevich, 1931). Pentru a face acest lucru, se prelevează un eșantion total dintr-un lot de semințe din diverse locuri, se numără 200 de semințe și 25 de bucăți se introduc în vasele Petri pe mediu de agar.

La determinarea infecției de suprafață, semințele nu sunt sterilizate, pentru a stabili o infecție profundă, se păstrează în permanganat de potasiu (0,5) timp de 2-3 minute sau se înmoaie în alcool pur timp de 1 minut.

În unele cazuri, semințele igienizate sunt tăiate în două părți cu un bisturiu steril. Semințele puternic mumificate sunt incubate preliminar pe hârtie de filtru umezită cu apă sterilă, după uscare și flacără, sunt introduse în vasele Petri. Pe măsură ce apare sporularea patogenă, acestea sunt transferate în agar oblic.

Când o cultură pură este izolată, ciupercile sunt cultivate preliminar pe mediu agar ușor acidulat sau gelatină (N. A. Naumov, 1937). În timpul izolării inițiale a agentului patogen, nu pot fi utilizate medii lichide sau foarte umezite, deoarece acest lucru contribuie la dezvoltarea microbilor saprofiti. De asemenea, nu trebuie să semeni ciuperci patogene pe un mediu nutritiv solid: orez, cartofi, pâine și alte produse.

Pentru identificarea agenților patogeni care persistă în sol, în scopul izolării lor ulterioare, eșantioanele sunt prelevate din diferențele caracteristice ale solului (podzol, chernozem, serozem etc.) la diferite adâncimi din anumite culturi, etc. La prelevare, secțiunea solului este apoi sterilă instrumentul separă stratul dorit, din care se prelevează o probă de 10-20 g, plasându-l într-un vas sau plic steril. Se recomandă luarea solului de la picioarele superioare (până la 3 cm) și mai adânc, la nivelul locației masei principale a rădăcinilor. Pentru a caracteriza pe deplin situl, este necesar să obțineți informații despre culturile anterioare și aciditatea solului (pH) în trei ani.

Când se studiază distribuția infecției în câmp, gropile de sol sunt excavate la fiecare 5 m într-o zonă uniformă; pentru sondaje de recunoaștere, sunt suficiente 5-10 gropi de sol pe secțiune.

Solul colectat este uscat timp de câteva zile într-o stare uscată în aer în plicuri de hârtie, zdrobit și placat pe un mediu nutritiv cu agar, folosind o spatulă, bisturiul și alte unelte sterile. Fiecare probă (10-20 g) este distribuită în 6–7 vase Petri, apoi vasele sunt păstrate într-un termostat la o temperatură de 20-25 ° С și vizualizate periodic. Pe măsură ce se dezvoltă colonii fungice, acestea sunt transferate pe agar oblic în eprubete. Prezența ciupercilor izolate este determinată prin metode convenționale. După 7-8 zile de la debutul creșterii coloniei, cupele devin improprii pentru depistarea ciupercilor din cauza poluării mediului prin microorganisme saprofite.

Studiul fungilor-micromicetelor solului este posibil prin izolarea lor într-o cultură pură sau prin metoda „plăcilor de murdărit”, microcamere de sol, pedoscopuri din sticlă foarte subțire și alte tehnici.

Izolarea microorganismelor, inclusiv a ciupercilor fitopatogene, într-o stare viabilă de apă și aer este o zonă de cercetare specială. Există diferite metode de analiză folosind probe, capcane automate de spori volumetrice și inerțiale (F. Gregory, 1964- Yu. P. Bochkov, A.I. Voronova, V. F. Dumsky, 1966- A.I. Klochko, 1969 etc. )..